Autophagy︱张志东团队揭示STING1诱导自噬调控RNA病毒感染的新机制

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撰文︱张  瑞

责编︱王思珍

干扰素反应刺激因子cGAMP相互作用因子1（stimulator of interferon response cGAMP interactor 1，STING1）是介导胞内DNA诱导先天免疫应答的一个关键性接头蛋白，主要通过cGAS-STING1信号通路发挥免疫防御作用【1】。环鸟苷酸腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase, cGAS）识别并结合细胞质内双链DNA，将三磷酸腺苷( adenosine triphosphate，ATP )和三磷酸鸟苷( guanosine triphosphate，GTP)合成2'3'-环化鸟苷酸-腺苷酸( cyclic GMP-AMP，cGAMP )。cGAMP作为第二信使，与位于内质网膜上的接头蛋白STING1结合，使其构象发生变化，进而激活STING1【2】。随后，STING1由内质网向高尔基体转移，并在此过程中招募和激活TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1），激活的TBK1招募并磷酸化干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3），活化的IRF3易位至细胞核，激活I型干扰素相关基因的表达【3】。

近年来，越来越多的研究表明，STING1在抗RNA病毒感染中同样起到了关键作用。STING1基因敲除小鼠或细胞对西尼罗河病毒（WNV）、登革热病毒（DENV）、仙台病毒（SeV）和水疱性口炎病毒（VSV）等多种RNA病毒的易感性明显升高【4-6】。STING1的敲除会导致VSV和SeV诱导的I型IFN表达下降【4,5,7-8】，但也有研究显示STING1缺失并不影响SeV和VSV感染诱导的IFNβ表达，而是通过抑制蛋白翻译限制RNA病毒的复制【6】。这些研究结果表明，STING1对细胞抗RNA病毒感染具有重要作用，但其分子机制尚不清楚。

2021年8月2日，西南民族大学畜牧兽医学院病毒感染与免疫团队首席张志东教授和中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物病毒病团队秦晓东博士共同通信在Autophagy上发表了题为STING1 is essential for an RNA-virus triggered autophagy的研究论文（在读博士研究生张瑞和秦晓东博士为该论文的共同第一作者），提出了STING1通过诱导自噬调控RNA病毒复制的重要机制。在此项研究中，研究人员发现RNA病毒感染后通过STING1激活整合应激反应（integrated stress response，ISR）诱导细胞自噬，促进病毒复制；自噬负反馈降解STING1，维持细胞内稳态。本研究阐明了STING1调控RNA病毒感染的作用机制，揭示了STING1在细胞抗RNA病毒感染防御中诱导自噬的功能，强调了STING1在细胞应激反应和天然免疫反应之间的连接作用。

口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）是小核糖核酸病毒科的成员，具有大约 8.5 kb的正义RNA基因组【9】。FMDV感染导致细胞应激反应和自噬【10】，但尚不清楚FMDV如何启动信号级联反应以及应激反应是否与先天免疫反应协调或抵消。之前的研究中，该团队发现FMDV感染激活真核翻译起始因子2 α激酶3（EIF2AK3/PERK）-真核翻译起始因子2A（EIF2A/eIF2α）信号通路并最终导致自噬。通过敲低ATG5阻断自噬可抑制FMDV复制【10】。EIF2AK3位于蛋白质合成和折叠的重要场所——内质网。内质网除了作为“蛋白质工厂”之外，还是一个转导抗病毒信号的枢纽【11】。那么定位于内质网膜的抗病毒蛋白STING1是否因小核糖核酸病毒感染而受到干扰？

为了探究小核糖核酸病毒感染对STING1的影响，研究人员首先检测了病毒感染后不同时间点宿主细胞（PK-15细胞）内STING1蛋白的表达情况，发现病毒感染3小时引起STING1蛋白的降解；随后，作者分别使用Z-VAD-FMK（Caspase抑制剂）、MG132（蛋白酶体抑制剂）和CQ（自噬抑制剂）处理细胞，发现自噬抑制剂CQ抑制了FMDV诱导的STING1的降解。另外，FMDV感染通过转染sh-RNA敲低自噬关键蛋白（ATG7、ATG5）或选择性内质网自噬受体蛋白（RETREG1）的细胞后观察不到STING1的降解。表明FMDV感染诱导内质网自噬降解STING1。 

为了探究STING1在FMDV感染中的作用，作者利用RNAi和CRISPR-Cas9技术分别构建了STING1敲低或敲除的细胞系，发现FMDV感染STING1缺失细胞不能诱导EIF2AK3介导的ISR和自噬，同时病毒复制被抑制。说明STING1是FMDV激活EIF2AK3诱导自噬、促进病毒复制的必需上游分子。

接着，作者进一步利用RNAi和CRISPR-Cas9技术构建了一系列基因敲低或敲除的细胞系来探究激活STING1的信号分子以及STING1如何激活自噬，鉴定出模式识别受体，即RNA传感分子RIG-I（也称DDX58）能够将信号传递给STING1，另外结合免疫共沉淀，发现STING1通过与内质网膜蛋白EIF2AK3相互作用，激活EIF2AK3-EIF2A信号级联，诱导自噬，进而促进病毒复制。

作者在STING1敲除细胞中过表达或回补表达了一系列STING1突变体或截短体，发现，使用H-151抑制STING1活化不影响自噬诱导和病毒复制；FMDV感染STING1 ^E69A（STING1不能发生磷酸化）回补表达细胞能够激活自噬降解STING1，而STING1 ^C148A（STING1不能发生寡聚化）回补表达细胞感染FMDV后不发生自噬，STING1不降解，非变性胶结果也显示，FMDV感染能够引起STING1的寡聚化。另外，病毒感染STING1 ^1-340（不能诱导干扰素反应）回补表达细胞能够诱导自噬和STING1的降解。这些结果表明：在FMDV感染过程中，STING1的转运和激活并不是诱导自噬的必要条件，STING1诱导自噬的能力取决于STING1的寡聚化，但不依赖于STING1的磷酸化和激活。

 工作总结图：STING1调控RNA病毒感染的作用机制

（图片来源：张志东实验室）

文章结论与讨论

STING1调控RNA病毒复制的功能早已明确【2-5】，但STING1抗RNA病毒感染的作用机制至今知之甚少。在本研究中，作者发现小核糖核酸病毒感染诱导的级联反应起始于模式识别受体RIG-I，RIG-I将信号传导至衔接蛋白STING1，STING1通过与内质网膜蛋白EIF2AK3相互作用，激活ISR，诱导自噬，促进病毒复制。反过来，自噬通过负反馈降解STING1，抑制病毒复制，维持胞内稳态。

本研究表明RIG-I和STING1位于响应病毒感染诱导自噬的EIF2AK3-EIF2A途径的上游，这种自噬诱导不需要STING1运输，与此一致，研究发现RNA病毒感染诱导的RIG-I和STING依赖性翻译抑制途径独立于STING1运输【6】。由于已知EIF2A会影响翻译【12】，因此，自噬诱导和翻译限制很可能都是病毒感染后RIG-I/STING1激活事件的下游结果。接下来，重要的是揭示RIG-I将信号传输到STING1和下游翻译抑制/ISR的机制。

总的来说，这项研究阐明了STING1调控小核糖核酸病毒感染的分子机制，揭示了STING1在RNA病毒感染过程中诱导诱导自噬的生物学功能。

原文连接：https://doi.org/10.1080/15548627.2021.1959086

张瑞（一排右一），秦晓东（二排右二），张志东（二排右三）

（图片来源：张志东实验室）

本研究得到国家重点研发计划（2016YFE0204100）、国家自然科学基金（31801191）和西南民族大学科研启动基金（125900/16011211013）的支持。

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往期文章精选【1】Nature︱星形胶质细胞来源的IL-3调控小胶质细胞功能, 缓解AD病理变化和认知障碍

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参考文献（上下滑动查看）  

【1】 Hopfner, K. P. & Hornung, V. Molecular mechanisms and cellular functions of cGAS-STING signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 501-521 (2020).

【2】 Kranzusch, P. J. et al. Ancient Origin of cGAS-STING Reveals Mechanism of Universal 2',3' cGAMP Signaling. Molecular cell 59, 891-903 (2015).

【3】 Liu, S. et al. Phosphorylation of innate immune adaptor proteins MAVS, STING, and TRIF induces IRF3 activation. Science (New York, N.Y.) 347, aaa2630 (2015).

【4】 Ishikawa, H. & Barber, G. N. STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling. Nature 455, 674-678 (2008).

【5】 Aguirre, S. et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS pathogens 8, e1002934 (2012).

【6】 Franz, K. M., Neidermyer, W. J., Tan, Y. J., Whelan, S. P. J. & Kagan, J. C. STING-dependent translation inhibition restricts RNA virus replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 115, E2058-e2067 (2018).

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【9】 Belsham, G. J. Translation and replication of FMDV RNA. Current topics in microbiology and immunology 288, 43-70, doi:10.1007/3-540-27109-0_3 (2005).

【10】 Sun, P. et al. Foot-and-mouth disease virus capsid protein VP2 activates the cellular EIF2S1-ATF4 pathway and induces autophagy via HSPB1. Autophagy 14, 336-346, (2018).

【11】 Senft, D. & Ronai, Z. A. UPR, autophagy, and mitochondria crosstalk underlies the ER stress response. Trends in biochemical sciences 40, 141-148 (2015).

【12】 Adomavicius, T. et al. The structural basis of translational control by eIF2 phosphorylation. Nature communications 10, 2136 (2019).

制版︱王思珍

本文完